Soutenance mémoire
Activation du lymphocyte T : rôle des molécules de costimulation
Les différents partenaires
La transmission du signal délivré par le TCR met en jeu des interactions protéineprotéine au sein de microdomaines membranaires (les rafts) riches en glycosphingolipides et en cholestérol, permettant la formation de complexes multimoléculaires. Les partenaires de la signalisation possèdent dans leur structure des régions qui vont permettre des liaisons spécifiques. Ainsi, les domaines SH2 (Src Homology) se lient à des tyrosines phosphorylées, les domaines SH3 à des régions riches en proline, les domaines PH (Pleckstrin Homology) reconnaissent des phosphoinositides, et les domaines PTB (PhosphoTyrosine Binding) des séquences NPXY (N=asparagine, P=proline et Y=tyrosine) où la tyrosine n’est pas nécessairement phosphorylée. L’interaction des domaines extracellulaires du TCR avec ses ligands conduit à l’activation d’une cascade de protéines kinases.Les événements précoces de la signalisation mènent à l’activation de trois familles de tyrosines kinases et au recrutement de molécules adaptatrices ; les protéines tyrosines kinases (PTK) appartiennent aux familles des Src kinases (Lck, Fyn), des Syk kinases (ZAP-70), ou des Tec kinases (Tec, Itk). Les protéines adaptatrices, qu’elles soient membranaires telles que LAT, PAG/Cbp, TRIM, … ou cytosoliques comme SLP-76, Cbl, Gads, … permettent la constitution de complexes multimoléculaires et le couplage à des protéines effectrices : phospholipase C 1 (PLC1), phosphatidyl inositol-3 kinase (PI-3kinase), protéine kinase C (PKC), mitogen activated protein (MAP) kinases. Au niveau de la zone de contact entre le lymphocyte T et la cellule présentatrice d’antigène (CPA) se forme une zone de contact appelée synapse immunologique ou SMAC (Supra Molecular Activation Cluster), qui va regrouper les partenaires de la réponse et ordonner les interactions. Dans cette aire de contact, les différentes molécules de surface et les protéines intracellulaires s’organisent en deux régions concentriques. La région centrale regroupe le complexe TCR-CD3, le CD4 ainsi que des protéines de signalisation (Lck, Fyn, PKC), tandis que la région périphérique contient l’intégrine LFA1 et la taline (qui permet la connection avec les filaments d’actine) (Grakoui et al., 1999 ; Monks et al., 1997).La formation de la synapse immunologique nécessite un cytosquelette fonctionnel. Nous allons dans un premier temps mettre en place les principales voies activées par le TCR (Figure 1). Le TCR est composé des chaînes polymorphes et (qui reconnaissent l’ensemble peptide-complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) exprimé par la CPA) et des chaînes invariantes , , et du CD3, associées de façon non covalente. La transduction du signal par le TCR est rendue possible par les domaines intracytoplasmiques des sous-unités du CD3, qui contiennent des résidus tyrosines organisés selon des motifs spécifiques (Y-X-XI/ L-X6-8-Y-X-X-I/L) appelés ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif). Les chaînes du CD3 contiennent chacune un motif ITAM à l’exception de la chaîne qui en possède trois.
Les tyrosines kinases de la famille Src
Les Src kinases Lck et Fyn jouent un rôle essentiel dans l’activation via le TCR. En effet, chez les souris déficientes pour Lck, les lymphocytes T présents (en faible nombre) en périphérie sont incapables de répondre à une stimulation antigénique (Molina et al., 1992). La lignée Jurkat déficiente pour Lck (JcaM1) ne répond pas à un engagement du complexe TCRCD3 (Straus and Weiss, 1992). Les hybridomes transfectés avec une forme constitutivement active de Lck présentent une augmentation de la phosphorylation sur tyrosine (après stimulation par un anticorps anti-TCR) et une augmentation de la production d’interleukine-2. Fyn joue un rôle moins important que Lck dans l’activation du TCR. En effet, les souris déficientes pour Fyn ne présentent qu’un défaut partiel de signalisation du TCR-CD3 dans les cellules T périphériques (Stein et al., 1992). Lck semble donc compenser (au moins partiellement) les fonctions de Fyn dans les cellules T périphériques, mais l’inverse n’est pas toujours vrai.Il faut néanmoins souligner que Fyn peut compenser les fonctions de Lck dans le cas d’une stimulation par un superantigène (Yamasaki et al., 1997). Lck et Fyn sont myristoylées et donc ancrées à la membrane plasmique où elles interagissent, respectivement, avec le co-récepteur CD4 et les chaînes du CD3. Après activation, ces tyrosines kinases sont positionnées à proximité des ITAM, facilitant ainsi la phosphorylation de leurs résidus tyrosines. Au repos, la tyrosine 505 de Lck est phosphorylée, autorisant une fixation à son propre domaine SH2 et une conformation inactive. Après engagement du TCR, la phosphatase CD45 déphosphoryle Y505, permettant un dépliement de la protéine qui s’autophosphoryle (Y394) et devient active. La phosphorylation de la tyrosine 505 est contrôlée par des actions opposées entre la tyrosine phosphatase CD45, qui active Lck, et la tyrosine kinase Csk (C-terminal Src Kinase), qui inhibe Lck.En effet, le niveau de phosphorylation de la tyrosine 505 de Lck est augmenté dans les lymphocytes T issus des souris déficientes pour CD45 (Ostergaard et al., 1989). Csk est une tyrosine kinase qui présente une structure similaire aux PTK de la famille Src, sans les sites de myristoylation et sans phosphorylation sur tyrosine, ce qui la rend constitutivement active. Csk phosphoryle la tyrosine 505 de Lck et ainsi l’inactive. Csk est recrutée à la membrane via l’interaction de son domaine SH2 avec la protéine adaptatrice PAG/Cbp (Kawabuchi et al., 2000). La surexpression de PAG/Cbp dans les cellules T Jurkat diminue l’activité des Src kinases et l’activation de NFAT induite par le TCR. De plus, dans les cellules T primaires, la phosphorylation de PAG/Cbp est diminuée après stimulation par le TCR et son association avec Csk est réduite (Brdicka et al., 2000). Ces données suggèrent que PAG/Cbp couple Csk à Lck/Fyn dans les microdomaines membranaires, permettant à Csk de maintenir les PTKs de la famille Src dans un état inactif dans une cellule au repos.
Lors de l’engagement du TCR, PAG/Cbp est déphosphorylé par une phosphatase non identifiée à l’heure actuelle, ce qui conduit à la dissociation de Csk de la protéine adaptatrice et à sa perte d’activité vis-à-vis des Src kinases. Il a été également montré que le domaine SH3 de Csk fixe la tyrosine phosphatase cytoplasmique PEP (Cloutier and Veillette, 1996). Or cette phosphatase diminue la phosphorylation des sites de régulation positifs de Lck et de Fyn (Y394 et Y417, respectivement), ce qui résulte en une inactivation des deux PTKs de la famille Src (Cloutier and Veillette, 1999). L’inactivation de Csk dans les thymocytes mène à la maturation des cellules T CD4+ indépendamment du TCRet des molécules de classe II, confirmant le rôle de Csk dans la signalisation du TCR (Schmedt et al., 1998).
Phosphorylation des ITAM
La présence de dix ITAM associés au TCR souligne l’existence d’une amplification de la réponse, puisqu’une molécule de TCR peut recruter (au moins théoriquement) jusqu’à dix molécules ZAP-70. L’utilisation de récepteurs chimériques ayant la partie extracellulaire du récepteur de l’interleukine-2 ou de la molécule CD8 et la partie intracellulaire de la chaîne CD3 ou suggère que les ITAM des différentes chaînes ne sont vraisemblablement pas strictement équivalents pour transduire le signal (Jensen et al., 1997 ; Letourneur and Klausner, 1992). Le rôle essentiel de la chaine dans la transduction du signal est un sujet de discussion. Le groupe de Malissen a montré que les événements d’activation et les fonctions effectrices n’étaient pas modifiés dans des cellules T CD8+ exprimant un TCR transgénique avec des chaînes dépourvues d’ITAM (Ardouin et al., 1999) : les ITAM des autres chaînes semblent pallier l’absence des motifs de la chaîne .La phosphorylation des ITAM de la chaîne semble un phénomène ordonné. Van Oers et al. proposent un modèle dans lequel la phosphorylation des ITAM serait progressive à partir de la région C-terminale (van Oers et al., 2000). Le groupe d’Allen a quant à lui montré, en utilisant des anticorps spécifiques de chaque phosphotyrosine des ITAM de la chaîne , que l’engagement du TCR induit la phosphorylation séquentielle et ordonnée de ces tyrosine par les PTKs de la famille Src (Kersh et al., 1998). La phosphorylation complète des ITAM de la chaîne est associée à la prolifération d’un clone T et à la production d’IL-2 dans un hybridome alors qu’une phosphorylation partielle inhibe ces réponses. De plus, ces auteurs ont montré que la phosphorylation complète de la chaîne est dépendante de la force d’engagement du ligand (Kersh et al., 1998).Les formes intermédiaires de phosphorylation des ITAM pourraient recruter différentes protéines adaptatrices et effectrices et donc activer différentes voies de signalisation. Le travail d’Osman et al. va dans ce sens. Ils ont étudié la fixation de ZAP-70, des protéines adaptatrices Grb2 et Shc et de la sous-unité p85 de la PI- 3kinase sur les dix ITAM. L’affinité de ces protéines est variable, que l’on considère les différents ITAM de la chaîne ou ceux des autres chaînes (Osman et al., 1996).
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Table des matières
INTRODUCTION
Partie I : Les principales voies de signalisation dans les lymphocytes T après reconnaissance de l’antigène
1. Signalisation en aval du récepteur T pour l’antigène
1.1. Les différents partenaires
1.2. Les événements précoces de la signalisation
1.2.1. Les tyrosines kinases de la famille Src
1.2.2. Phosphorylation des ITAM
1.2.3. Les tyrosines kinases de la famille Syk
1.3. La voie de la phospholipase C gamma
1 1.4. La voie calcique..
1.5. Les protéines kinases C
1.6. Les GTPases
1.7. La voie des MAP kinases
1.8. La voie de la PI-3kinase
2. Activation du lymphocyte T : rôle des molécules de costimulation
Partie II : Les populations lymphocytaires Th1 et Th2
1. Les lymphocytes Th1
2. Les lymphocytes Th2
3. Polarisation de la réponse T CD4 et équilibre Th1/Th2
3.1. Rôle des cytokines dans la différenciation lymphocytaire
3.1.1. Polarisation Th1
3.1.2. Différenciation Th2
3.1.3. Effets régulateurs des cytokines de type Th1 et Th2
3.2. Autres facteurs influençant la différenciation Th1/Th2
3.2.1. Les cellules présentatrices d’antigènes
3.2.2. L’antigène
3.2.3. Les facteurs génétiques
4. Différences entre les cellules Th1 et Th2
4.1. Les récepteurs membranaires
4.2. Les facteurs de transcription
4.2.1. Les facteurs de transcription spécifiques
4.2.1.1. Les facteurs de transcription spécifiques des cellules Th1
4.2.1.2. Les facteurs de transcription spécifiques des cellules Th2
4.2.2. Les facteurs de transcription ubiquitaires 4.3. Remodelage de la chromatine
4.4. Voies de signalisation
4.4.1. Voies de signalisation des récepteurs des cytokines
4.4.1.1. Les récepteurs de cytokines dans les lymphocytes Th1
4.4.1.2. Les récepteurs de cytokines dans les lymphocytes Th2
4.4.2. Voies de signalisation des récepteurs des chémokines
4.4.3. Voies de signalisation des molécules de costimulation
4.4.4. Voies de signalisation activées par le TCR
4.4.4.1. Importance de l’intensité de stimulation du TCR dans la signalisation Th1/Th2
4.4.4.2. Rôle des tyrosines kinases dans l’équilibre Th1/Th2
4.4.4.3. Rôle des MAP kinases dans les différences Th1/Th2
Partie III : Les modèles animaux de désordres immunopathologiques de type Th1 et Th2
1. Environnement, équilibre Th1/Th2 et manifestations allergiques
2. Les modèles animaux de désordres immunopathologiques de type Th1
2.1. L’encéphalomyélite autoimmune expérimentale
2.2. Autres modèles de maladies de type Th1
3. Les modèles animaux de désordres immunopathologiques de type Th2
3.1. Les maladies induites par les sels de métaux lourds
3.2. Modèle animal de l’asthme allergique
4. Dualité Th1/Th2 : la fin d’un paradigme ? Partie IV : Présentation d’une voie de signalisation impliquée dans la production d’IL-4 par les lymphocytes Th2
1. Caractérisation de cette voie de signalisation 2. Les canaux calciques de type L
3. Les protéines kinases C OBJECTIFS MATERIEL ET METHODES
1. Animaux 2. Différenciation des cellules Th1 et Th2
3. Hybridome T
4. Mesure de la production d’IL-4 et d’IFN
5. Immunoempreinte
6. Transfection par des oligonucléotides antisens
7. Marquage des récepteurs à la dihydropyridine et microscopie confocale
8. Analyse de la concentration intracellulaire en calcium
9. Etude du potentiel membranaire
10. Traitement des rats BN avec les sels d’or 11. Induction de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale 12. Analyse statistique RESULTATS
1. Etude des DHPR dans des lymphocytes Th2 et des modèles animaux
1.1.Les sous-unités 1C et 1D sont exprimées dans les cellules Th2 murines mais pas dans les lymphocytes Th1
1.2.Des oligonucléotides antisens 1C et 1D inhibent l’expression des DHPR, la réponse calcique, et la synthèse d’IL-4 par les lymphocytes Th2
1.3.Etude du potentiel membranaire des lymphocytes Th2 suite à l’engagement du TCR
1.4.Un inhibiteur des DHPR prévient l’apparition d’une maladie autoimmune médiée par les lymphocytes Th2, mais n’a pas d’effet sur une maladie de type Th1
2. Etude des isoformes de PKC intervenant dans la synthèse d’IL-4
1.1.Etude des isoformes de PKC exprimées par les lymphocytes Th1 et Th2 1.2.Effets d’oligonucléotides antisens ciblant les isoformes de PKC sur la production d’IL-4 et d’IFNpar un hybridome T DISCUSSION
1. Les récepteurs à la dihydropyridine : un nouveau canal calcique dans les lymphocytes Th2
2. Régulation des DHPR dans les lymphocytes Th2
3. Effet d’inhibiteurs des canaux calciques sur des maladies de type Th2
4. Protéines kinases C et production d’IL-4 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
1. Fonctionnement des canaux calciques sensibles à la DHP dans les lymphocytes Th2
2. Intérêt des inhibiteurs de canaux calciques dans le traitement des maladies de type Th2
3. Rôle des isoformes de PKC dans les propriétés effectrices des lymphocytes Th2 REFERENCES
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