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Activation des liaisons C-H en Biologie
Oxydation par insertion d’oxygène
Les enzymes catalysant des réactions d’oxydation par activation de liaison C-H peuvent être classées en trois groupes : les enzymes sans cofacteur métallique, les métalloenzymes héminiques et les métalloenzymes non-héminiques (Lewis et al. 2011). Ces trois types de protéines sont présents en particulier chez les organismes aérobies car elles utilisent généralement le dioxygène comme accepteur d’électrons pour fonctionner.
Flavines et flavoprotéines
Les flavoprotéines sont des enzymes capables de catalyser des réactions d’oxygénation et qui ne contiennent pas d’atome métallique participant à la catalyse (Barquera et al. 2002). Ces enzymes possèdent un cofacteur organique, une flavine, qui peut exister sous trois états redox différents. On connait trois types de flavine : la flavine mononucléotide (FMN), la flavine adénine dinucléotide (FAD) et la riboflavine .
La réactivité de ces composés provient de leur partie hétérocyclique isoalloxazine expliquant le fait que ces trois systèmes emploient le même mécanisme réactionnel. (Massey et al. 2000 ; Van Berkel et al.2006 ; Lewis et al. 2011) .
Dans le mécanisme présenté ci-dessus, l’étape clé est l’état réduit qui, en présence de dioxygène, conduit à un intermédiaire peroxo pouvant alors transférer un atome d’oxygène au substrat. Il existe de nombreux exemples décrits dans la littérature, un des plus connus est celui de la luciférase (Campbell et al. 2009 + Sucharitakul et al. 2014) .
La luciférase est une enzyme bactérienne qui catalyse l’oxygénation d’une longue chaine aliphatique au niveau d’une fonction aldéhyde pour former un acide carboxylique. Cette enzyme est notamment connue pour la luminescence associée à son activité.
Métalloprotéines héminiques
L’hème est un groupement prosthétique présent dans un grand nombre d’enzymes et qui leur confère une grande variété de réactivité (Sono et al. 1996). Il est constitué d’un noyau porphyrinique diversement substitué, coordiné à un atome de Fer au centre de la structure.
Cet édifice plan permet de doter l’atome de Fer de nouvelles propriétés, notamment la capacité d’atteindre des hauts degrés d’oxydation, FeIV et/ou FeV (Meunier et al. 2004). L’hème fixe le FeIII par l’intermédiaire de 4 azotes, la fixation à la protéine se fait par un résidu jouant le rôle de cinquième ligand du Fer et la sixième position de coordination est classiquement occupée par une molécule d’eau facilement échangeable. Dans la littérature, les exemples les mieux décrits concernent les cytochromes P450 qui sont capables de réaliser une multitude de réaction d’oxydation de liaisons C H .
Les cytochromes P450 sont capables d’activer une molécule de dioxygène pour former une espèce intermédiaire très oxydante FeV=O. Cette espèce oxyde des liaisons C-H peu réactives et réalise des oxygénations par un mécanisme dit « oxygen rebound ». Le mécanisme est le suivant : l’enzyme à l’état FeIII est réduite en FeII. Sous cet état elle peut alors fixer et réduire une molécule de dioxygène pour générer un intermédiaire superoxo. Ce dernier est réduit à un électron pour former l’espèce peroxo puis hydroperoxo après protonation, En présence d’un électron l’oxygène distal est éliminé sous la forme d’une molécule d’eau donnant naissance à l’intermédiaire FeV -oxo mentionné plus haut. En présence du substrat, cet intermédiaire est capable d’arracher un atome d’hydrogène et le radical substrat obtenu « rebondit » sur le FeIV -OH formé pour donner le produit hydroxylé et l’enzyme à l’état FeIII.
Métalloprotéines non-héminiques
Les métalloprotéines non héminiques capables d’activer des liaisons C-H pour réaliser des oxydations utilisent généralement le Fer ou le cuivre pour réaliser ce type de réactions (Lipscomb et al. 1996 ; Que et al. 2004). Dans le cas des métalloprotéines à Fer, on distingue deux sous-groupes : les enzymes avec un seul Fer (mononucléaire de Fer) et les enzymes contenant deux atomes de Fer (binucléaire de Fer). L’un des exemples les plus étudiés de métalloprotéines à Fer non-héminique est celui de la méthane monooxygénase (MMO) .
Cette enzyme possède un site actif composé de deux fers non-héminiques à ponts µhydroxo capables d’activer le dioxygène pour réaliser l’oxygénation du méthane (ou d’alcane). Le mécanisme fait intervenir des intermédiaires Fe-oxo à hauts degrés d’oxydation similaires à ceux impliqués dans les hémoprotéines et capables d’activer le substrat sous forme radicalaire. L’étape clé est, ici aussi, la réduction du centre binucléaire bi ferrique en centre bi ferreux. Ce dernier réagit avec le dioxygène pour conduire à un intermédiaire bi ferrique à pont µ-peroxo. Un des deux oxygènes du peroxo est réduit à deux électrons par les deux Fer puis éliminé sous la forme d’une molécule d’eau. L’apport de deux électrons (fournis par le binucléaire) et de deux protons conduit à l’élimination d’une molécule d’eau et à un binucléaire de FeIV lié par deux ponts, un µ-hydroxo et un µ-oxo. Ce binucléaire de FeIV est proposé catalyser l’oxydation de la liaison C-H du substrat qui peut ensuite être oxygéné. Ce type de système peut également utiliser le peroxyde d’hydrogène pour produire directement l’intermédiaire avec deux FeIII et le pont µ-peroxo (peroxide shunt). Ce mécanisme de la MMO est valable pour l’oxygénation du méthane mais également pour l’oxygénation d’alcanes plus longs.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
I – Activation des liaisons C-H en Biologie
I-1) Oxydation par insertion d’oxygène
I-1-a. Flavines et flavoprotéines
I-1-b. Métalloprotéines héminiques
I-1-c. Métalloprotéines non-héminiques
I-2) Les Cobalamines
I-2-a. Le cofacteur adénosylcobalamine
I-2-b. Mécanisme radicalaire des enzymes adénosylcobalamines
I-2-c. Exemples de protéines à cofacteur cobalamine
I-3) Activation radicalaire par enzymes Fer-Soufres
I-3-a. les enzymes [4Fe-4S] ATP-dépendantes
I-3-b. Les enzymes Radical SAM
I-3-b-1. La S-Adénosyle-méthionine (SAM)
I-3-b-2. Le centre [4Fe-4S] radical-SAM
I-3-b-3. Mécanisme de réductolyse de la SAM
II – Les centres Fe-S
II-1) Biogénèse et fonctions des centres Fe-S
II-1-a. Biosynthèse des centres Fe-S
II-1-b. Fonctions des centres Fe-S
II-2) Diversité et structures des centres Fe-S
II-2-a. Centre [2Fe-2S]
II-2-b. Centre [4Fe-4S]
II-2-c. Autres types de centre Fe-S
II-3) Spectroscopie des centres [4Fe-4S]
II-3-a. La spectrophotométrie UV-visible des centres [4Fe-4S]
II-3-b La spectroscopie RPE des centres [4Fe-4S]
II-3-c. La spectroscopie Mössbauer des centres [4Fe-4S]
II-3-d. Les centres [4Fe-4S] différenciés
III – Les enzymes d’insertion radicalaire
III-1) Insertion de sulfure : BioB et LipA
III-2) Insertion de méthylsulfure : RimO et MiaB
III-3) Insertion de composé à deux carbones : TYW1
IV – Problématique de la thèse : double utilisation de la SAM
V – Présentation des chapitres de la thèse
V-1) Chapitre I : Caractérisation biochimique et spectroscopique de RimO
V-2) Chapitre II : Etude biochimique et spectroscopique du site actif de RimO
V-3) Chapitre III : Etude de RimO en présence de SAM
V-4) Chapitre IV : Formation de complexe enzyme-substrat pour la cristallogenèse
V-5) Chapitre V : Etude du mécanisme enzymatique de la réaction catalysée par TYW1
MATERIELS & METHODES
I – Matériel biologique
I-1) Souches bactériennes
I-1-a. E. coli XL1-Blue (Stratagene®)
I-1-b. E. coli DH5α
I-1-c. E. coli BL21(DE3)
I-1-d. E. coli BL21(DE3)-RIL (Codonplus®)
I-1-e. E. coli MiaB- (TX3346)
I-2) Plasmides de surexpression
I-2-a. RimO-Tm-p7-7
I-2-b. MiaB-Tm-pT7-7
I-2-c. TYW1-PAB2039-pT7-7
I-2-d. T7RNAP-6H-pET-3a
I-2-e. TEV-pMal
I-2-f. ARNt-Phe-pUC18
I-2-g. ARNt-Phe-pTRC99Phe
I-2-h. AspB-6H-pBAD
I-3) Milieux de cultures
II – Biologie moléculaire
II-1) Préparation des bactéries compétentes
II-2) Transformation des bactéries
II-3) Production et purification de plasmide
II-4) Mutagénèse dirigée
III) Techniques biochimiques
III-1) Surproduction des protéines et ARNt
III-1-a. Surexpression des protéines thermophiles
III-1-b. Surexpression des ARNt-Phe et ARNt-Ser
III-1-c. S12 : le substrat de l’enzyme RimO
III-2) Purification des protéines
III-2-a. Préparation des extraits solubles de protéines
III-2-b. Purification sur colonne hydrophobe Butyl-Sépharose
III-2-c. Préparation des apoprotéines
III-2-d. Purification sur colonne d’exclusion Superdex®
III-2-e. Purification sur colonne d’affinité Ni-NTA
III-2-f. Purification sur colonne d’affinité Héparine
III-3) Purification des ARN de transferts
III-3-a. Extraction des ARNt
III-3-b. Purification sur colonne d’affinité Nucleobond®
III-3-c. Purification sur colonne d’hydroxyapatite-céramique
III-4) Reconstitution des centres [4Fe-4S] de protéines thermophiles
III-4-a. Réaction de reconstitution en conditions anaérobies
III-4-b. Purification des protéines reconstituées
III-4-c. Réduction chimique des protéines reconstituées
III-5) Dosages biochimiques
III-5-a. Dosage de protéines
III-5-b. Dosage de Fer
III-5-c. Dosage du Soufre
III-6) Transcription in vitro
III-6-a. Préparation de l’ADN matrice
III-6-b. Réaction de transcription in vitro
III-6-c. Purification des transcrits
III-7) Tests d’activités enzymatiques
III-7-a. Tests d’activités avec RimO, MiaB et TYW1
III-7-b. Tests d’activité avec MiaA et TRM5
III-7-c. Digestion des ARNt
III-7-d. Formation de complexe enzyme/substrat/co-substrat
IV – Techniques analytiques
IV-1) Chromatographie liquide haute performance (HPLC)
IV-1-a. Analyse HPLC du peptide-S12
IV-1-b. Analyses HPLC des ARNt
IV-1-c. Analyses HPLC des sous-produits de réaction
IV-2) Spectrométrie de masse
IV-2-a. Analyses du peptide mimétique S12
IV-2-b. Analyses des nucléotides
V – Techniques spectroscopiques
V-1) La spectroscopie UV-visible
V-2) La spectroscopie RPE en onde continue (CW)
V-3) La spectroscopie RPE en onde pulsée HYSCORE
V-2) La spectroscopie Mössbauer
VI – Synthèses bio-organiques et organiques
VI-1) Biosynthèse et purification de la SAM
VI-2) Synthèse et purification d’aspartates deutérés R et S en position β
VI-3) Synthèse de mime peptidique à partir des aspartates deutérés
VII – Electrochimie des protéines
RESULTATS & DISCUSSIONS
CONCLUSION
