Acides nucléiques, hybridation et fluorescence

Acides nucléiques, hybridation et fluorescence 

Les acides nucléiques

Il existe deux types d’acides nucléiques : l’ADN et les ARN. L’ADN ou acide désoxyribonucléique est le support de l’information génétique. En effet, il est divisé en segments d’ADN qui correspondent à des gènes (ou unités de transcription) qui eux même codent pour une protéine. Les ARN (acide ribonucléique) ont soit un rôle de support de l’information afin d’être traduit en protéines (ARN messager), ou bien un rôle structural et fonctionnel (ARN ribosomiques, ARN de transferts et autres petits ARN). Ces acides sont appelés nucléiques en raison de leur abondance dans les noyaux cellulaires où ils ont été isolés pour la première fois en 1869 par Miescher sous le nom de « nucléine » [5]. Les acides nucléiques sont constitués d’acides phosphoriques, de pentoses et de bases azotés.

L’acide phosphorique
L’acide phosphorique est un triacide dont une fonction acide est dissociée permettant de donner une charge négative à l’ADN, et dont les deux autres peuvent former des liaisons phosphodiester.

Les pentoses
Les pentoses sont des glucides cycliques à 5 atomes de carbone qui sont sous forme de β-D-ribofurane et sous forme « désoxy » pour l’ADN.

Les bases
Il existe cinq bases d’acide nucléiques naturelles. On parle de bases azotées, de base nucléiques ou de nucléobases. Trois d’entre elles sont communes aux ADNs et aux ARNs. On peut décomposer ces bases en deux familles : les bases dites «puriques » (A et G) qui sont construites sur un motif purine et les bases pyrimidiques (C, T et U), basées sur un motif pyrimidine.

L’association d’une base et d’un pentose par une liaison N-glycosidique est appelée un nucléoside et l’association d’un nucléoside et de l’acide phosphorique par une liaison phosphodiester en 5’ du pentose est appelée un nucléotide.

L’ADN contrairement à l’ARN est une molécule bicaténaire étant constituée de deux brins dirigés de manière antiparallèle et associés en doubles hélices de type B. Il est constitué d’autant de bases puriques que de bases pyrimidiques, en effet il y a autant d’adénine que de thymine, et autant de guanine que de cytosine. Les deux brins sont liés grâce à des liaisons hydrogènes présentes entre toutes les bases de l’ADN : deux liaisons hydrogènes entre les bases A et T, et trois liaisons hydrogènes entre les bases G et C. Les forces dues à ces liaisons hydrogènes sont supérieures aux forces répulsives (dues aux charges négatives des groupements phosphates sur chaque brin) qu’il y a entre les charges moins présentes sur les deux brins de l’ADN. La double hélice de l’ADN a un diamètre de 20 Å, un pas de 34 Å qui correspond à 10 nucléotides. L’hélice est dite droite car elle s’enroule à droite en la regardant du haut vers le bas. Entre deux paires de bases on mesure un angle de 36°. De plus la molécule d’ADN est dextrogyre, c’est-à-dire qu’elle a la propriété de faire dévier le plan de polarisation de la lumière polarisée vers la droite.

Propriétés physico-chimiques de l’ADN

Absorption UV

En biologie moléculaire, il est important de quantifier et d’analyser la pureté des acides nucléiques après leur purification. La méthode la plus utilisée pour le dosage d’acides nucléiques est la spectrophotométrie qui mesure l’absorbance (ou densité optique) des acides nucléiques à 260 nm (absorbant dans l’ultraviolet). La spectrophotométrie d’absorption dans l’UV est une méthode très courante en laboratoire. Elle repose sur la propriété des molécules (Ex. acides nucléiques, protéines …) d’absorber des radiations lumineuses à une longueur d’onde déterminée. L’absorbance (A) aussi appelée Densité Optique (D.O) est la mesure quantitative d’absorption d’une radiation UV-visible à une longueur d’onde donnée par un composé ou un échantillon. Les nucléotides absorbent dans les UV et cette absorption dépend de l’angle d’incidence des rayons UV.

L’absorbance A est définie par Log(I0/I) où I0 est l’intensité de la lumière incidente et I est l’intensité transmise après le passage à travers la cuve contenant la solution ou l’échantillon.

Dénaturation thermique 

La dénaturation thermique correspond au fait que les deux brins de l’hélice se dissocient par l’action de la chaleur. La température de fusion ou Tm est la température à laquelle la molécule d’ADN est à moitié désappariée. Elle dépend de la longueur de la molécule d’ADN. En effet les petites molécules sont moins stables et ont donc une température de fusion plus faible. Elle dépend aussi de la richesse en paires de bases C-G (40% dans le cas du génome humain) celles-ci plus stables que les paires de bases A-T, ce qui augmente la température de fusion [6]. La Tm est de 86°C pour le génome humain et la dénaturation complète est à 95°C. La dénaturation est mesurable par la mesure du Tm, en effet la dénaturation augmente l’absorption des rayons UV, ceci est appelé l’effet hyperchrome. La température de fusion est représentée sous la forme d’une courbe sigmoïde (Figure 10) qui traduit l’effet coopératif de la dissociation de l’ADN. Le chemin inverse de la courbe correspond à la renaturation. Elle se fait lors d’un refroidissement lent pour permettre la réassociation des deux brins. Lorsque le refroidissement est trop rapide, la réassociation est irréversible. La renaturation est seulement possible pour des petites molécules d’ADN. L’augmentation des forces ioniques du milieu réactionnel (NaCl par exemple) permet une renaturation plus facile, les cations Na+ neutralisant les forces répulsives de l’ADN.

Le polymorphisme de l’ADN

Le polymorphisme correspond aux variations de la séquence nucléotidique de l’ADN d’un gène dans une population [7]. Par exemple les gènes qui codent pour des protéines ne représentent que 3% du génome humain, le restant de la molécule d’ADN (97%) est non codante. De plus la structure de l’ADN humain est très variable d’un individu à un autre et ces variations sont surtout présentes au niveau de ces parties non codantes, mais aussi au niveau des gènes codants.

Table des matières

I Chapitre 1: Introduction générale
II Chapitre 2 : Acides nucléiques, hybridation et fluorescence
II.1 Les acides nucléiques
II.1.1 L’acide phosphorique
II.1.2 Les pentoses
II.1.3 Les bases
II.2 Propriétés physico-chimiques de l’ADN
II.2.1 Solubilité
II.2.2 Absorption UV
II.2.3 Dénaturation thermique
II.2.4 Le polymorphisme de l’ADN
II.3 Hybridation des acides nucléiques : Idées générales
II.3.1 Puce à ADN
II.3.1.1 Fabrication de la puce
II.3.1.2 Préparation des cibles
II.3.1.3 Hybridation des cibles avec les sondes
II.3.1.4 Lecture brute des données
II.3.1.5 Analyse des données
II.4 Technique de détection par fluorescence
II.4.1 Liste des matériels utilisés dans ce travail
II.4.2 Fixation des sondes
II.4.3 Préparation des lames
II.4.4 Macrodépôts
II.4.5 Microdépôt
II.5 Paramètres influençant l’hybridation
II.5.1 Effet de la température
II.5.1.1 Expérience
II.5.1.2 Observation
II.5.1.3 Conclusion
II.5.2 Effet de la concentration en sels
II.5.2.1 Expérience
II.5.2.2 Observation
II.5.2.3 Conclusion
II.5.3 Durée d’hybridation
II.5.3.1 Expérience
II.5.3.2 Observations expérimentales
II.5.3.3 Conclusion
II.6 Hybridation en compétition
II.6.1 Expérience
II.6.2 Observations
II.6.3 Conclusion
II.7 Hybridation des produits THRCA
II.7.1 Expérience
II.7.2 Observations
II.7.3 Conclusion
II.8 Conclusion du chapitre
III Chapitre 3 : Le graphène
III.1 L’élément carbone
III.2 Le graphène
III.2.1 Structures
III.2.1.1 Structure cristallographique
III.2.1.2 Structure atomique
III.2.1.3 Structure de la bande d’ énergie
III.2.2 Transport électronique dans le graphène
III.2.2.1 L’effet de champ
III.2.2.2 La mobilité du graphène
III.2.3 Autres propriétés du graphène
III.3 Technique de fabrication du graphène
III.3.1 L’exfoliation mécanique
III.3.2 L’exfoliation chimique
III.3.3 La sublimation du SiC
III.3.4 Le dépôt chimique en phase vapeur CVD
III.4 Caractérisation Raman du graphène
III.4.1 La Spectroscopie Raman
III.4.1.1 Principe
III.4.1.2 Spectre Raman du graphène
III.4.1.3 Qualité du graphène
III.4.1.4 Nombre de couches
III.4.1.5 Niveau de dopage
III.5 Conclusion du chapitre
IV Chapitre 4 : Graphène et ses applications
IV.1 Le graphène, matériau du futur
IV.1.1 Biocompatibilité du graphène
IV.2 Les biocapteurs à base du graphène
IV.2.1 Introduction aux biocapteurs
IV.2.1.1 Classification des biocapteurs
IV.2.1.2 Evaluation de la performance d’un biocapteur
IV.2.2 Détection avec le graphène
IV.2.2.1 Graphène FET pour détecter le glucose
IV.2.2.2 Graphène FET comme détecteur de gaz
IV.2.2.3 Graphène FET comme détecteur de pH et de protéines
IV.2.2.4 Graphène FET comme détecteur d’acides nucléiques
IV.3 Conclusion du chapitre
V Chapitre 5 : Nanofabrication et caractérisation des réseaux de GFETs
V.1 Transfert du graphène
V.1.1 Dégazage de l’eau
V.1.2 Support mécanique
V.1.3 Retrait du graphène de la deuxième face
V.1.4 Dissolution de la feuille de cuivre
V.1.5 Retrait de la feuille de cuivre
V.1.6 Nettoyage du substrat
V.1.7 Protection du graphène
V.2 Les différentes étapes de lithographie
V.2.1 La lithographie
V.2.1.1 Première lithographie
V.2.1.2 Deuxième lithographie
V.2.1.3 Troisième lithographie
V.2.2 Métallisation
V.2.3 Passivation
V.2.3.1 Dépôt de Al2O3 par ALD
V.2.3.2 Dépôt de SiOx par PECVD
V.2.3.3 Découpe de la couche de passivation
V.3 Mesure électrique
V.3.1 Types de dopage
V.3.2 Le réseau
V.3.2.1 Stabilisation des caractéristiques
V.3.2.2 Transport électronique dans le graphène
V.3.2.3 Mobilité
V.3.2.4 Mesure d’hystérèse
V.4 Effet du recuit
V.4.1 Effet du recuit sur les contacts : contact Cr/Au et contact Ti/Au
V.5 Bonding manuelle de la puce
V.6 Conclusion du chapitre
VI Chapitre 6 : Conclusion générale

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