IBTSS-05-OMM
Acide gamma amino-butyrique ou GABA
Introduction
Le principe de la validation des procédures analytiques est aujourd’hui largement, répandu dans tous les domaines d’activités ou des mesures sont réalisées. Le champ d’application de la validation analytique s’étend à toute procédure d’analyse utilisée dans le contrôle de la matière première, le développement galénique, le contrôle en cours de fabrication, le contrôle des produits intermédiaires et finis et les essais de stabilité de tous les produits pharmaceutiques.
La validation analytique est fondée sur une analyse statistique basée sur un certain nombre de critères aboutissant à des méthodes analytiques permettant de donner des résultats fiables.
Au cours de ce travail nous allons valider la technique de dosage du clonazépam qui est un médicament anxiolytique appartenant à la classe des benzodiazépines.
Le dosage de cette molécule qui s’inscrit dans le cadre du suivi thérapeutique adapté par le laboratoire du Centre Hospitalier Hassan II est effectué par chromatographie liquide à haute performance de détecteur à barre diode.
Dans le présent rapport nous présentons d’abord, le laboratoire d’analyse (Lieu de stage) ensuite une étude bibliographique qui portera sur les benzodiazépines et la méthodologie de validation analytique.
Dans la partie expérimentale, nous évaluons la validité de la méthode d’analyse du clonazépam (Rivotril) par HPLC, en générant plusieurs modèles statistiques dans l’objectif
de choisir le modèle adéquat pour pouvoir en fin calculer les différentes critèrs de validation et de déterminer le domaine de validité de la méthode.
Présentation du centre hospitalier Hassan II Fès (CHU)
Le CHU Hassan II de Fès est considéré comme un fleuron du secteur de la santé au Maroc. Il permet la formation théorique et pratique des futurs Professionnels médicaux, personnels paramédicaux, et chercheurs en sciences de la santé.
Etude bibliographique
BENZODIAZEPINES
Définition
Les benzodiazépines (BZD) sont une classe des composés chimique formés d’un cycle de diazépine fusionné avec un cycle de benzène. Elles forment une classe de médicaments psychotropes utilisés dans le traitement de l’anxiété, de l’insomnie, de l’agitation psychomotrice, et des convulsions. Elles sont efficaces, très bien tolérées et ne présentent que peu d’effets secondaires.
Historique
En 1952, la seule molécule anxiolytique disponible était le méprobamate (Equanil), mais l’arrivée des benzodiazépines dans les années 60 a marqué un tournant dans la prise en charge des états anxieux. La première benzodiazépine introduite fut le chlordiazepoxide (Librium) (1961) relayée en 1964 par le diazépam (Valium), qui reste la référence. Depuis, plus de deux mille molécules ont été synthétisées et les benzodiazépines représentent actuellement une des classes thérapeutiques les plus employées en médecine humaine. Toutes les benzodiazépines ont une action, anxiolytique1, anticonvulsivante2, myorelaxante3 et amnésiante4.
Propriétés physicochimiques des benzodiazepines
Propriétés physiques
Les benzodiazépines se présentent sous la forme de poudres cristallines blanches ou légèrement jaunâtres, inodores et de saveur amère
Propriétés chimiques
Les benzodiazépines sont très peu solubles dans l’eau, mais parfaitement solubles dans des solvants organiques comme le chloroforme, l’éthanol et l’éther. Leurs sels sont solubles dans l’eau.
Ce sont des bases, forte pour le chlordiazépoxide, faibles pour les autres composés ce qui permet leur dosage par potentiomètrie.
Mode d’action
Les benzodiazépines se lient uniquement au récepteur GABA-A, et augmentent la fréquence d’ouverture des canaux chlorés, alors que les barbituriques augmentent la durée d’ouverture de ces canaux.
Clonazépam
Définition
Le clonazépam est connu sous le nom médicamenteux RIVORIL, il s’agit d’une molécule médicamenteuse particulièrement puissante à propriétés, hypnotiques anxiolytiques et anticonvulsivants. Le clonazépam est utilisé pour traiter les troubles convulsifs.
Il agit en ralentissant l’activité des nerfs dans le cerveau (c.-à-d. du ystème nerveux central).
Symptomatologie
Troubles neurologiques : vont de la simple somnolence, à la torpeur6, au coma.
On peut observer des troubles visuels tels qu’une diplopie7, une dysarthrie8, des vertiges, une ataxie9, un délire10 et hallucination11.
La rapidité d’installation du coma et sa profondeur dépendent de l’âge, de la quantité ingérée, des antécédents du patient (insuffisance respiratoire…), et de l’éventualité d’une prise associée (alcool, médicament…).
Dépression respiratoire : la dépression respiratoire est très rare, et souvent très modérée.
Effet vasoplégiant : les troubles vasoplégiques 12sont modérés. Ils se traduisent le plus souvent par une hypotension artérielle et rarement par une bradycardie sinusale13. Troubles de la mémoire : ils sont prolongés pour les benzodiazépines à demie vie longue, à type d’amnésie de fixation, parfois d’amnésie antérograde14.
Traitement symptomatique
Bien conduit, le traitement symptomatique est souvent suffisant pour assurer l’évolution favorable de ce type d’intoxication.
Validation analytique
Méthode analytique
Une analyse chimique peut être définie comme une suite d’opérations élémentaires, statistiquement indépendantes les unes des autres, qui commencent au moment de la prise d’essai (prélèvement d’un échantillon analytique sur l’échantillon de laboratoire) et aboutissent à l’expression d’un résultat d’analyse qu’il faudra valider pour pouvoir disposer enfin d’une donnée analytique.
cycle de vie d’une méthode analytique
Validation analytique
Il s’agit d’un ensemble des opérations nécessaires pour prouver que le protocole analytique est suffisamment exacte et fiable pour avoir confiance dans les résultats fournis et ceci pour un usage déterminé. La validation d’une méthode analytique passe par différentes étapes qui visent : à tester la normalité de la distribution des mesures et l’estimation de l’erreur de justesse, ou biais systématique, et de l’erreur aléatoire, qu’il faut combiner pour vérifier si la méthode remplit les objectifs qui lui ont été assignés.
Spécificité / sélectivité
Spécificité
La spécificité d’une procédure analytique est sa capacité d’établir l’existence de la substance à analyser en présence d’autres composants présents.
Il s’agit de démontrer que la substance analysée au sein de la matrice est bien l’analyte recherché. Très souvent la spécificité se fonde sur une absence d’interférences. Lorsque l’on ne peut pas évaluer l’influence de chaque constituant de la matrice, une technique commode d’emploi permettant d’évaluer l’influence de certaines interférences est la méthode des ajouts dosés.
Elle consiste à ajouter à l’échantillon avant, pendant, ou après sa préparation des quantités connues de l’analyte. On examine alors si la réponse de l’instrument de mesure correspond au signal initial augmenté du signal correspondant à la quantité ajoutée.
Sélectivité
La sélectivité peut se définir comme l’aptitude d’un élément de la méthode d’analyse (appareil de mesure, milieu de culture, etc…) à discerner un analyte donné dans un mélange complexe.
L’examen de la sélectivité s’effectue par l’analyse d’un blanc matrice (plasma, urine,…) en démontrant l’absence de réponse au temps de rétention de l’analyte par comparaison avec une solution pure de l’analyte.
Sensibilité
La sensibilité d’une méthode représente la pente de la droite d’étalonnage, si la courbe d’étalonnage n’est pas une droite, dans ce cas la sensibilité à une concentration donnée sera définie comme la pente de la tangente à la courbe à cette concentration.
Il est clair que plus la sensibilité sera élevée plus il sera facile de distinguer deux échantillons de concentration voisine.
Il apparaît également qu’une augmentation de la sensibilité permettra d’obtenir des limites de détection ou de quantification plus basses.
Validation analytique basée sur le profil d’exactitude et la notion de l’erreur totale
Cette nouvelle stratégie de validation permet d’associer les deux éléments fondamentaux
de la validation qui sont la justesse et la fidélité au résultat final d’une mesure, et par conséquent de tenir compte de l’erreur totale de mesure (erreur systématique + erreur
aléatoire).
Interprétation
Pour utiliser le profil d’exactitude en vue de valider une méthode, il faut avoir fixé les deux critères de décision suivants :
les limites d’acceptabilité ±λ : Elles servent à traduire les objectifs pratiques des utilisateurs. Elles délimitent un intervalle autour de la valeur de référence.
Le plus souvent, ces limites sont réglementaires ou issues de la réglementation.
Mais dans le cas où il n’existe pas de référence établie, il convient de prendre en compte les attentes des utilisateurs finaux, comme une LQ donnée.
la proportion β : Elle représente la proportion de futurs résultats qui seront en moyenne compris dans les intervalles de tolérance. La valeur choisie pour β dépend largement du champ d’application (contrôle sanitaire, contrôle de fabrication, etc.).
Il est évident que plus β est petit, par exemple 70 %, plus la méthode risque de produire des résultats qui ne correspondent pas aux spécifications annoncées. C’est pourquoi, dans la méthode du profil d’exactitude cette proportion a été fixée à 80 %, au moins.
Choisir la procédure d’étalonnage pour la routine
Dans la mesure où avec les méthodes indirectes on dispose de données d’étalonnage, il est possible de construire plusieurs profils d’exactitude avec le même jeu de données mais en utilisant différents modèles d’étalonnage. On peut alors sélectionner le profil le plus favorable ou la procédure d’étalonnage la plus simple qui, malgré tout, permet d’atteindre l’objectif fixé.
Vérification de la méthode
Finalement, lors de l’application en routine de la méthode ainsi validée, il convient de vérifier de façon régulière si les résultats obtenus restent acceptables, par exemple au moyen d’une carte de contrôle, en particulier, si on utilise un facteur de correction (Feinberg M., 2010c). Des actions correctives inefficaces peuvent ainsi conduire à la revalidation de la méthode.
Conclusion
La méthode est bien sélective car le pic du clonazépam est bien isolé à un temps de rétention de Tr=23,57 min
Profil d’exactitude
Pour tracer le moyen principal de la validation par l’approche de l’erreur totale qui est le profil d’exactitude, on réalise des analyses de deux matrices différentes, une matrice d’étalonnage (principe actif seul), et une matrice de validation (principe actif dans le sérum).
Choix du modèle d’étalonnage le plus adéquat
Pour but de choisir le modèle le plus adéquat qui est capable de produire une proportion suffisante de futures mesures qui se situeront à l’intérieur de la zone d’acceptabilité, nous avons généré plusieurs modèles reliant la surface de pic à la concentration. La méthode de calcul est la méthode de régression aux moindres carrés. Un modèle est calculé pour chaque jour. Les tableaux suivants regroupent les résultats des calcules statistiques pour tous les modèles générés.
Conclusion
Pour objectif d’étudier la validation de la méthode de dosage du clonazépam par HPLC au centre hospitalier HASSAN II, nous avons commencé dans un premier temps par une étude bibliographique concernant la molécule étudiée et l’approche adoptée au cours de la validation de la méthode d’analyse.
Dans la partie pratique, nous avons pu démontrer dans un premier temps la sélectivité de
la méthode d’analyse en se basant sur les chromatogrammes obtenus.
Ensuite, après réalisation des expériences sur une gamme d’étalonnage et une gamme de validation, on a calculé les différents critères statistiques des différents modèles générés pour pouvoir construire les profils d’exactitude.
L’analyse des profils d’exactitude nous a permis de sélectionner le modèle logarithmique
qui satisfait nos besoins.
L’existence d’une sous-estimation des biais relatifs, nous a exigé d’introduire un facteur de correction pour corriger la justesse de la méthode dans l’intervalle de concentration étudié.
Le profil d’exactitude final obtenu caractérisant la méthode est valide tout au long de l’intervalle de concentration étudié (50 à 2000 μg/l). Tout en gardant à l’esprit qu’on espère avoir 95% des futurs résultats de la méthode qui seront inclus entre les limites d’acceptation fixées à ±15 % avec un risque de 5%.
|
Table des matières
I. Introduction
II. Présentation du centre hospitalier Hassan II Fès (CHU)
Partie bibliographique
I. BENZODIAZEPINES
1. Définition
2. Historique
3. Structure générale
4. Classification des benzodiazépines
5. Propriétés physicochimiques des benzodiazepines
5.1 Propriétés physiques
5.2 Propriétés chimiques
6. Acide gamma amino-butyrique ou GABA
7. Récepteurs et effets GABA-A
7.1 Mode d’action
8. Doses toxiques
9. Clonazépam
9.1 Définition
9.2 Pharmacotoxicologie
9.2.1 Absorption
9.2.2 Distribution
9.2.3 Excrétion
9.3 Symptomatologie
9.4 Traitement symptomatique
П. Validation analytique
1. Méthode analytique
2. Cycle de vie d’une méthode analytique
3. Validation analytique
4. Normes et guidelines de validation
5. Critères de validation
5.1 Spécificité / sélectivité
5.2 Sensibilité
5.3 Linéarité
5.4 Justesse
5.5 Fidélité
5.6 Fidélité et justesse
5.7 Limite de détection LDM
5.8 Limite de quantification
5.9 Robustesse
6. Validation anal ytique basée sur le profil d’exactitude et la notion de l’erreur
totale
6.1 Profile d’exactitude
6.1.1 Etapes d’établissement du profil d’exactitude
6.1.2 Fonctions de réponse
6.1.3 Calcule des critères de validation
6.1.4 Construction graphique et interprétation
Partie pratique
I. Dosage du clonazépam
1. Méthode
1.1 Principe
1.2 Matériel et réactifs
1.3 Mode opératoire
1.4 Résultats
II. Validation statistique de la méthode du dosage du clonazépam
1. Spécificité / sélectivité
2. Profile d’exactitude
2. 1 Choix du matériau de validation
2. 2 Choix du domaine de validation
2. 3 Plan expérimental
2.3.1 Plan d’étalonnage
2.3.2 Plan de validation
2. 4 Sélection des limites d’acceptation
2. 5 Choix du modèle d’étalonnage le plus adéquat
2.6 Calcul des critères de la validation
2.6.1 Calcul des concentration retrouvées après correction
2.6.2 Calcul de la justesse
2.6.3 Calcul de a fidélité
2.6.4 Calcul des intervalles de tolérance
2.7 Profil d’exactitude après correction
3. Calcul de la limite de quantification et de détection
III. Conclusion
Télécharger le rapport complet
