La RMN quantitative pour l’analyse isotopique : la RMN isotopique 13C

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Paramètres qualités et métrologiques en RMN

Exactitude : fidélité (précision) et justesse

Les mesures quantitatives données par différentes techniques analytiques sont caractérisées par une fidélité (ou précision, c’est le terme qui sera utilisé dans la thèse), une justesse et une exactitude. Ces trois concepts, [18] ont été définis en 2012 par le groupe de travail du comité commun pour les guides en métrologie (JCGM/WG 2) : VIM (Vocabulaire International de Métrologie) [19] et leur utilisation a été commentée par Prenesti et al. [20] Dans la suite de la thèse, ce sont les significations attribuées par VIM qui seront utilisées.

La précision est donnée par l’écart entre des résultats indépendamment obtenus dans les mêmes

conditions de répétition. Elle traduit la répétabilité de la méthode et elle est représentée par l’écart-type s ou par le coefficient de variation (CV) sur plusieurs répétitions qui est exprimé en % (Eq. 1.11). (%) =∙ 100(1.11)

Où la moyenne et l’écart-type calculés pour un nombre de séries fini.

La justesse Δ (%) représente l’écart entre la valeur moyenne obtenue à partir d’un ensemble de résultats et une valeur de référence acceptée. Elle est calculée grâce à l’équation (Eq. 1.12). ∆(%)=−∙ 100(1.12)

Où représente la valeur calculée et la valeur vraie. Un défaut de justesse se traduit par un biais. Enfin, l’exactitude combine la précision et la justesse d’un résultat, caractérisée par l’écart entre une valeur mesurée et une valeur de référence (Figure 6). Elle est associée à l’erreur totale (contribution des erreurs systématique et aléatoire) et est de nature qualitative.

Sensibilité, limite de détection et quantification

La limite de détection (LOD, pour « limit of detection ») et de quantification (LOQ, pour « limit of quantification ») sont des paramètres importants pour la validation d’une méthode analytique. La sensibilité est souvent confondue avec la LOD, alors que la définition métrologique de la sensibilité est la suivante : quotient de la variation d’une indication d’un système de mesure par la variation correspondante de la valeur de la grandeur mesurée. [19] C’est donc la capacité d’un instrument à distinguer deux valeurs correspondant à des quantités différentes. En RMN, la LOD représente la quantité de produit minimal pouvant être détectée. Cette limite peut être déterminée visuellement ou mathématiquement [21] et elle est reliée à la mesure du rapport signal sur bruit (S/B). Une valeur de S/B de 3 est généralement considéré comme acceptable pour estimer la limite de détection. [21] Cependant, l’intensité du signal dépend de la forme de ce dernier (largeur, couplage) et du nombre de noyaux correspondants. Dans le langage courant RMN, la sensibilité prend la définition de la LOD et sera utilisée dans ce sens dans la suite de la thèse.
La LOQ est la concentration de l’analyte, pour laquelle le signal sélectionné présente le S/B minimal requis pour la précision de la méthode visée, [21] plus de détail sur l’impact du S/B sur la précision est donné dans la section 2.2.4.1 de ce chapitre.

Paramètres influençant la justesse

La justesse est impactée par des erreurs dites systématiques, [18] comme la saturation partielle, les effets d’off-resonance, le découplage et la géométrie de la sonde.

Typologie des sondes

Dans les sondes RMN, la bobine accordée à la fréquence de résonance 13C (de hauteur H) émet les impulsions RF 13C. La bobine accordée à la fréquence des protons (de hauteur H’) est utilisée pour émettre les impulsions RF 1H. En configuration directe, le signal est détecté par une bobine de hauteur H et le découplage hétéronucléaire est réalisé grâce à une bobine de hauteur H’ supérieure H (Figure 13a). En configuration inverse, les rôles des deux bobines sont inversés (Figure 13b). L’efficacité d’une bobine RF décroit fortement à proximité des bords pour devenir nulle à l’extérieur. Il faut donc considérer que le découplage, dont l’efficacité est directement liée à celle des impulsions RF, n’est correctement réalisé que pour une hauteur utile Hu. Cette hauteur est inférieure à H’ (lors d’une observation directe avec découplage 1H) et inférieure à H (lors d’une observation inverse avec découplage 13C). Compte tenu de la faible différence entre
H et H’ dans les sondes utilisées actuellement, même lorsque la bobine la plus haute est utilisée pour le découplage, une partie des noyaux observés n’est pas correctement découplée. Ceci conduit à des distorsions dans les intensités et les formes de raie, et la justesse des mesures est alors détériorée.

Stabilité du spectromètre et de l’échantillon

Les instabilités du spectromètre et de l’échantillon au cours du temps peuvent impacter la répétabilité de l’analyse et donc la précision comme c’est le cas du champ magnétique et de la température de l’échantillon. [36,37]

La température est un paramètre important en RMN quantitative. Elle peut affecter les propriétés de relaxation des molécules, [36] créer des artéfacts sur le spectre [36] et également modifier les déplacements chimiques. [38] C’est pourquoi, la température de l’échantillon doit impérativement être stable pendant les expériences.

L’inhomogénéité du champ magnétique peut créer des distorsions de signal et des formes de raie inappropriées. [36] Il est important que le champ magnétique soit optimisé et stable dans le temps afin d’avoir une bonne résolution (largeur à mi-hauteur du signal) et donc une bonne précision. Les inhomogénéités du champ magnétique peuvent également provenir de l’échantillon. Ce dernier doit être stable, ne présenter aucune évolution physique ou chimique au cours du temps : recristallisation, précipitation, hydrolyse, interaction avec le solvant de lock.

Une quelconque inhomogénéité de l’échantillon peut provoquer des inhomogénéités de champ magnétique.

Impulsions RF

Les impulsions RF sont utilisées pour faire basculer. l’aimantation d’un angle β, et elles sont caractérisées par une durée et une amplitude 1 Des imperfections peuvent exister sur l’angle

β réellement appliqué et peuvent affecter directement des résultats quantitatifs.

Imperfections des impulsions

Les origines des imperfections des impulsions sont multiples et peuvent provenir de l’inhomogénéité du champ ⃗ 1 , un mauvais calibrage des impulsions, ou des problèmes d’off-resonance (Figure 14).

L’angle β doit être calibré avec une puissance et une durée données. Les calibrages sont eux-mêmes impactés par l’accord de sonde, la température et les concentrations de l’échantillon.

Il est nécessaire de refaire les calibrages pour chaque échantillon et avant chaque expérience afin d’avoir des expériences répétables et reproductibles. La méthode la plus simple et rapide pour faire ces calibrages est de déterminer le point d’annulation du signal pour un angle de bascule de 360° et de diviser la durée trouvée par 4 afin de connaitre la durée pour un 90°. Cette méthode, bien que rapide et facile à mettre en place, est dépendante de l’opérateur (lorsque l’estimation du point d’annulation n’est pas automatisée, ce qui est le cas le plus fréquent) etdonne seulement une valeur approximative du 90° [39] pouvant provoquer des imperfections sur l’angle β. Plus de détails sur cette méthode sont donnés dans le chapitre III. L’effet off-resonance peut également donner lieu à des imperfections (Cf. section 1.2.3.2 de ce chapitre). Les impulsions⃗ RF doivent être courtes afin de ne pas être sélectives, cependant la précession autour de 0 ne doit pas être négligée. L’effet des imperfections RF n’a pas le même effet sur le signal pour tous les angles de nutation. Les imperfections des impulsions sur un 90° réduisent toutes les surfaces des pics dans la même proportion, [40] les mesures quantitatives ne sont donc pas impactées par des imperfections sur les 90°. Mais cela n’est pas vrai pour les impulsions à 180°, c’est pourquoi de nouvelles impulsions ont été développées afin de compenser ces imperfections.

Impulsions composites

Les impulsions composites [41] sont constituées d’impulsions successives rectangulaires avec des délais très courts (négligeables) pour limiter la précession dans le plan transversal (xy). Chacune de ces impulsions a une phase différente et produit un angle différent.

L’impulsion (90°)x – (180°)y – (90°)x (Figure 15a)⃗ permet de compenser les imperfections dues aux calibrages ou à l’inhomogénéité de champ 1. L’imperfection de la première impulsion est compensée à l’aide de la dernière impulsion. Ainsi, toutes les trajectoires finissent près de l’axe -z ce qui montre l’erreur minime restante sur la position de l’aimantation. D’autres impulsions composites permettent de corriger les imperfections causées par l’effet d’off-resonance, c’est le cas de l’impulsion (90°)x – (240°)y – (90°)x (Figure 15b).

Ces impulsions sont utilisées pour remplacer les impulsions rectangles de 180° notamment dans les séquences multi-impulsionnelles. [42] Cependant, il n’est pas possible de compenser toutes les imperfections avec une même impulsion composite. Dans ce sens, les impulsions adiabatiques [33,43,44] sont plus efficaces.

Impulsions spatialement sélectives

Dans les impulsions modulées en fréquence et en amplitude, seule la gamme de fréquence modulée est excitée par l’impulsion. Ces impulsions en association avec un gradient ge de champ magnétique permettent de sélectionner une partie du tube. En effet, le gradient et l’impulsion sont appliqués simultanément, créant un encodage spatial qui suit la modulation en fréquence. Ainsi, cette combinaison permet de réaliser des expériences spatialement sélectives.

Les références en RMN quantitatives

Le signal obtenu en RMN est proportionnel au nombre de noyaux observés. Cette technique permet, à l’aide d’une référence, de connaitre la concentration d’un échantillon. Plusieurs références peuvent être utilisées, interne, externe, ou électronique. Ce paragraphe décrit les avantages et les inconvénients de chacune d’elles dans le contexte de justesse et de précision.

Référence interne chimique

Cette méthode consiste à additionner directement dans le tube RMN une molécule dite de référence afin de quantifier une autre molécule dont la concentration est inconnue. Comme déjà mentionné, le signal provenant de la molécule de référence obtenue en RMN est directement proportionnel : à son nombre de noyaux équivalents observés pour le site , à sa ( )( )1.28).(1.28) concentration, au volume sensibleet à la constante(Eq.( ) = . . .

La même formule peut être écrite pour la molécule à quantifier (Eq. 1.29). (1.29) équations donne la relation (Eq. 1.30) :

Le rapport entre les deux=…=…(1.30) dans la même préparation et dans le même tube, le volume sensible

Les deux molécules étant… r avec les=est dépendante de l’appareillage et peut observé est le même soit. La constante varie instabilités de l’appareil. Cependant, l’analyse est réalisée sur le même tube.

Zero-filling

Le FID est acquis analogiquement et il doit être digitalisé afin de pouvoir être stocké et traité. La transformation de Fourier permet de convertir un FID (domaine temporel) en spectre (domaine fréquentiel). Cependant, l’algorithme utilisé (TF) impose un nombre de points correspondant à une puissance de 2 et identique pour le spectre et le FID. Le nombre de point du FID est défini grâce à 2 paramètres : (i) l’intervalle entre 2 points (dwell time), qui est inversement proportionnel à la largeur spectrale définie et (ii) la durée de l’acquisition.

Cependant, augmenter la longueur de l’acquisition peut être limité avec la présence d’un découplage en créneau inverse. En effet, un découplage trop long peut provoquer une surchauffe de l’appareil et donc un endommagement de ce dernier. Le zero-filling [76] est une méthode permettant d’augmenter la résolution digitale en additionnant un nombre de points, dont la valeur est égale à 0, à la fin du FID (Figure 29). Ainsi, le nombre de points du FID n’est

plus obligatoirement une puissance de 2, et cela permet de choisir plus librement le temps de l’acquisition.

Figure 29 : Amélioration du spectre à l’aide du zero-filling. L’addition de point à la fin du FID permet

d’améliorer la résolution digitale du spectre. Ici, l’exemple est donné avec un doublet provenant du spectre 1H du di-acetone-D-glucose sur un FID de 49 019 points. Le spectre est présenté avec un nombre de points de : a) 16k ; b) 32k et c) 64k.

2.6.4. Apodisation

La longueur du FID est régie par la durée de l’acquisition. Si l’intégralité de l’aimantation n’est pas relaxée alors, le FID est tronqué provoquant des artéfacts qui impactent la forme des raies, la résolution et également le S/B. Pour éliminer la troncature, des fonctions mathématiques appelées fonctions d’apodisation, peuvent être appliquées sur le FID pour accélérer sa décroissance. Plusieurs fonctions sont possibles comme la fonction de Hanning, l’exponentielle décroissante, la fonction sinus, la transformation Lorentz-gauss (Figure 30).

Ces différentes fonctions ne présentent pas le même impact sur le spectre résultant. Les premiers points du FID donnent les informations sur la surface des signaux. Pour la RMN quantitative, il est important que la fonction soit égale à 1 au début du FID. La fonction

Chapitre I : Rappels bibliographiques

exponentielle décroissante (Eq. 1.42) est la plus utilisée en RMN quantitative, elle décroit de la même manière qu’un FID ce qui permet de préserver la forme lorentzienne de la raie.

− AVEC : = . (1.42)

Le paramètre LB traduit par line broadening est donné en Hz et correspond à l’élargissement des signaux. Cette fonction peut donc entrainer une diminution de la résolution.

Une façon d’augmenter la résolution est d’utiliser une fonction sinus (Figure 30d). L’application de cette fonction permet de diminuer les artéfacts mais une déformation du signal peut apparaitre de part et d’autre des signaux d’intérêt. Ces pics peuvent être éliminés en optimisant la position du maximum de la fonction. Cependant, cette fonction diminue le S/B et impacte les premiers points du FID entrainant une distorsion des intensités. Cette fonction n’est

pas utilisée en RMN quantitative.

Figure 30 : Application de différentes fonctions d’apodisation sur un FID. Le spectre de droite correspond au

spectre après transformation de Fourier du signal présent au centre obtenue lui-même par la multiplication du FID par la fonction d’apodisation présentée à gauche : a) aucune apodisation ; b) fonction de Hanning ; c)

fonction exponentielle décroissante ; d) fonction sinus ; e) transformation Lorentz-Gauss. [16]

2.6.5. Echantillonnage non-uniforme

L’échantillonnage non-uniforme (NUS) a été développé pour réduire le temps d’analyse des spectres multi-dimensionnels. Cette stratégie consiste à acquérir de façon non-uniforme une partie des points dans les dimensions indirectes. Ainsi, les points non acquis sont calculés grâce à des algorithmes de reconstruction pour obtenir le spectre multi-dimensionnel (Figure 31c). Plusieurs approches ont été développées pour échantillonner les points et pour les reconstruire.

[77] Un échantillonnage de 50 à 25% réduit le temps d’analyse de 2 à 4 fois. Le NUS permet

Chapitre I : Rappels bibliographiques

également d’augmenter la résolution sur deux expériences avec le même temps d’analyse, en effet, le gain de temps donne un spectre avec plus d’incréments. Le gain de résolution entraine un compromis avec la sensibilité, les points acquis à la fin de l’expérience souffrent plus de la relaxation entrainant une perte de sensibilité. Cette limitation peut être contournée en plaçant les points acquis essentiellement au début et les points à reconstruire plutôt à la fin de l’expérience. Des artéfacts peuvent être présents si le S/B ou le nombre de points échantillonnés n’est pas suffisant. [17]

L’utilisation des différents algorithmes est dépendant du logiciel de traitement mis en place par le constructeur. [17] Par exemple, les algorithmes de reconstruction couramment utilisés sont basés sur les techniques MDD (Multi-dimensional decomposition) [78], CS (Compressed Sensing) [79], ou encore la RMN de covariance [80]. Ils ont été développés sur différentes approches et ils impactent différemment le spectre obtenu.

2.6.6. Prédiction linéaire

La prédiction linéaire (LP) basée sur la technique des moindres carrés [81] peut être utilisée pour différents objectifs : de la rectification des données corrompus ou déformés à la génération complète de données dans le domaine fréquentiel. [82] L’utilisation courante de cette méthode est la prédiction des points à la fin d’un FID afin d’éviter une troncature (Figure 31d). En effet, au lieu d’ajouter des zéros comme le zero-filling (Cf. paragraphe 2.6.3 de ce chapitre), un algorithme prédit les points à l’aide des informations données par le point précédent et ainsi de suite. Ce processus donne lieu à l’extension du FID et permet d’augmenter la résolution, d’éviter l’utilisation d’une forte fonction d’apodisation et d’atténuer les erreurs de troncature.

L’application de la LP pour l’analyse 2D donne lieu à l’augmentation de la résolution et/ou la sensibilité en diminuant le temps d’analyse. [83] Tout comme le NUS, la LP nécessite un S/B important afin d’obtenir une bonne estimation ainsi qu’une reconstruction du spectre correct.

Détermination de la surface S

La RMN quantitative est basée sur la détermination de la surface du signal qui est joue un rôle crucial dans proportionnelle au nombre de spins. La détermination de la surface l’exactitude des résultats.

Intégration

L’intégration est une méthode primaire qui consiste à faire la somme de l’intensité de chaque point contenu dans une zone d’intégration, préalablement délimitée par des bornes d’intégration. Cette méthode est la plus simple car elle est implémentée dans les logiciels couramment utilisés en RMN. Cependant, le résultat est impacté par les bornes d’intégration, le phasage ou encore la ligne de base, rendant cette méthode dépendante de l’opérateur. Face à des recouvrements de signaux, l’intégration ne permet pas de déterminer précisément la surface de plusieurs raies pouvant se superposer.

Ajustement à un modèle théorique

Une autre méthode plus précise consiste à faire un ajustement des données à l’aide d’un modèle théorique. Cet ajustement peut se faire dans le domaine fréquentiel (spectre) ou dans le domaine temporel (FID).

Dans le domaine fréquentiel, cette méthode consiste à utiliser plusieurs fonctions lorentziennes, gaussiennes ou un mélange des deux, pour correspondre au spectre expérimental. Pour faciliter la convergence de l’algorithme, il est nécessaire d’indiquer plusieurs paramètres d’entrée comme la hauteur, la largeur à mi-hauteur, ou bien la fréquence de résonance. Après convergence, l’algorithme intègre la fonction théorique donnant la surface . Plusieurs logiciels peuvent être utilisés tel que PERCH (Perch NMR softwareTM, Perch solutions Ltd, Kuopio, Finland), Eurospec, [84] ou bien la librairie Rnmrfit utilisable sur logiciel R. [85] Grâce à cet ajustement, il est possible de séparer plusieurs signaux pouvant se recouvrir (Figure 32).

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Table des matières

REMERCIEMENTS
LISTE DES ACRONYMES ET DES SYMBOLES
INTRODUCTION
CHAPITRE I : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
1. Principe de la RMN
1.1. Application d’un champ magnétique
1.2. Relaxation
1.3. Le signal de RMN : Free Induction Decay (FID)
1.4. Du FID au spectre RMN
2. La RMN quantitative
2.1. Introduction
2.2. Paramètres qualités et métrologiques en RMN
2.3. Impulsions RF
2.4. Les références en RMN quantitatives
2.5. Séquences multi-impulsionnelles
2.6. Traitement du signal
3. La RMN quantitative pour l’analyse isotopique : la RMN isotopique 13C
3.1. Définitions
3.2. Méthodes d’analyses isotopiques
3.3. Détermination de la composition isotopique position-spécifique par irm-13C NMR
3.4. Développement des séquences utilisées
4. Variabilité intra et inter-instrumentale sur les δ13Ci
4.1. Composition isotopique : partielle, apparente et partielle apparente
4.2. Facteur de correction
CHAPITRE II : L’OBJECTIF ULTIME D’UNE METHODOLOGIE PSIA : LA JUSTESSE
1. Que mesure-t-on avec les différentes méthodes : exemple du n-propanol
2. Un trio complémentaire
3. Objectifs de la thèse
3.1. Précision
3.2. Justesse
CHAPITRE III : DEVELOPPEMENT ET OPTIMISATION D’UNE NOUVELLE STRATEGIE PLUS RAPIDE DE MESURE PAR IRM-13C NMR – HSQC SYMETRIQUE ADIABATIQUE
1. Développement de l’asHSQC
1.1. Obtention de la précision cible
1.2. Réduction du temps d’analyse
2. Calibrage rapide des impulsions RF
2.1. Courbe de nutation
2.2. Séquence MISSTEC
2.3. Evaluation des résultats
2.4. Optimisation du traitement des données
2.5. Impact de l’accord de sonde
2.6. Impact du radiation damping
2.7. Calibrage des impulsions de faible puissance
2.8. Echantillons réels
2.9. Comparaison avec d’autres méthodes rapides : la séquence PulsCal et le 360°/4
2.10. Calibrage du 13C
2.11. Conclusion
3. Analyse isotopique intramoléculaire du cholestérol : optimisation de la séquence asHSQC et évaluation de la précision
3.1. Préparation et analyse du cholestérol
3.2. Evaluation de la précision
3.3. Optimisation du temps d’expérience
3.4. Pure-shift
3.5. Concentration en cholestérol
3.6. Conclusion
4. Authentification de produits bio : le lait et le blé
4.1. Importance de l’authentification des produits bio
4.2. Compositions du lait et du blé
4.3. Préparation et analyse d’échantillon
4.4. Optimisation de l’asHSQC pour ces matrices
CHAPITRE IV : DES MESURES IRM-13C NMR HOMOGENES ET JUSTES
1. La composition intramoléculaire 13C du glucose comme outil de suivi de la réaction des arbres au changement climatique
1.1. Méthodologie
1.2. Nature des échantillons
1.3. Etude sur l’échange entre l’eau et la fonction hydroxyle du DAGF : justification du choix du dérivé
1.4. Préparation des échantillons et configuration du spectromètre
1.5. Optimisation de la séquence 2D
1.6. Optimisation du traitement de données et répétabilité de la séquence
1.7. Expression des résultats sur l’échelle δ13Ci
1.8. Conclusion
2. Homogénéisation des résultats d’irm-13C NMR
2.1. Méthodologie
2.2. Configuration des spectromètres
2.3. Résultats
3. Vers des valeurs justes : application sur l’alanine
3.1. Analyse irm-MS par fragmentation chimique et pyrolyse de l’alanine
3.2. Analyse par irm-13C RMN
3.1. Correction et expression des résultats
3.1. Conclusion
CHAPITRE V : REDUCTION DE LA DEPENDANCE A LA TYPOLOGIE DE LA SONDE
1. Développement de la séquence CWET
1.1. Stratégie
1.2. Création des impulsions
2. Séquence de calibrage : Echograd-13C
2.1. Optimisation de l’amplitude du gradient ?e
2.2. Echantillon pour calibrer les impulsions
2.3. Paramètres expérimentaux
2.4. Optimisation de la puissance d’atténuation
3. Evaluation de la justesse de la séquence CWET
3.1. Choix et préparation de l’échantillon
3.2. Traitement des données de la séquence CWET
3.3. Optimisation du délai τ
3.4. Optimisation de la largeur de l’impulsion
3.5. Optimisation du sens de balayage
4. Conclusion
CONCLUSION GENERALE
RÉFÉRENCES